Inhibitory PDE chronią wątrobę przed uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym

Czy niedokrwienie i reperfuzja zmieniają funkcjonowanie wątroby?

Uszkodzenie wątroby w wyniku niedokrwienia/reperfuzji (IR) stanowi poważne powikłanie w chirurgii wątroby, transplantologii oraz różnych formach wstrząsu krążeniowego. Jest to złożony proces, w którym uczestniczą liczne komórki zapalne i mediatory molekularne, prowadzące do śmierci hepatocytów i ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej. Stopień odpowiedzi zapalnej i dysfunkcji narządu zależy od czasu trwania niedokrwienia wątroby oraz występowania chorób podstawowych. Mimo że wiele środków farmakologicznych wykazuje działanie ochronne przed uszkodzeniem IR wątroby, takich jak antyoksydanty, ozon, agoniści adenozyny, donory tlenku azotu, sildenafil i wardenafil, tylko nieliczne zostały wprowadzone do praktyki klinicznej.

Tadalafil (TDF) jest silnym i selektywnym inhibitorem fosfodiesterazy typu 5 (PDE5), pierwotnie badanym jako potencjalny lek przeciwdławicowy, ale zyskał popularność w leczeniu zaburzeń erekcji i nadciśnienia płucnego. Opór naczyniowy wątroby jest regulowany przez skurcz lub rozkurcz komórek mięśni gładkich w końcowych arterioli. Z kolei okołozatokowe komórki gwiaździste regulują napięcie zatok w zależności od stężenia tlenku azotu (NO) syntetyzowanego przez komórki śródbłonka zatok. TDF, jako specyficzny inhibitor szlaku tlenku azotu (NO)/cyklicznego guanozynomonofosforanu (cGMP) w mięśniach gładkich naczyń i płytkach krwi, powoduje rozszerzenie obwodowych tętnic i żył oraz hamuje agregację płytek krwi. NO generuje cGMP, który wywołuje odpowiedź komórkową w postaci wazodylatacji. cGMP jest inaktywowany do GMP przez fosfodiesterazy, a hamowanie PDE wzmacnia i przedłuża komórkowe odpowiedzi wazodylatacyjne wywołane przez NO.

NO jest syntetyzowany przez jedną z trzech izoform syntazy tlenku azotu (NOS). Ekspresja neuronalnej NOS jest głównie ograniczona do tkanki nerwowej. Indukowalna NOS (iNOS) nie jest wyrażana w normalnych okolicznościach, ale ulega regulacji w górę podczas stanów zapalnych w hepatocytach, komórkach śródbłonka, komórkach żółciowych, komórkach Kupffera, neutrofilach i limfocytach T. Śródbłonkowa NOS (eNOS) jest konstytutywnie wyrażana w wielu typach komórek, w tym w komórkach śródbłonka wątroby i hepatocytach. Kilka badań wykazało ochronny wpływ TDF na uszkodzenie nerek, mięśnia sercowego i jąder w wyniku IR.

Pentoksyfilina (PTX) jest niespecyficznym inhibitorem PDE typu 4, wykazującym działanie rozszerzające naczynia krwionośne, szczególnie w wątrobie. Badania wykazały, że leczenie PTX przywraca obniżoną pojemność minutową serca i poprawia perfuzję wątroby oraz przepływ krwi w jelitach po krwotoku i resuscytacji. PTX hamuje produkcję czynnika martwicy nowotworów-α, interleukiny (IL)-1, IL-6 i IL-12 oraz zmniejsza stres oksydacyjny i wskaźniki zapalne. Chociaż TDF i PTX wykazały korzystne efekty, mechanizmy, poprzez które te leki wywierają ochronne działanie, nie są w pełni zrozumiałe w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR.

Istnieje kilka mechanizmów hamujących uszkodzenie IR, a wiele leków wykazało również działanie ochronne. Mechanizmy ochrony przed uszkodzeniem wywołanym przez IR są wieloczynnikowe. Zaproponowano szereg mechanizmów, w tym eliminację wolnych rodników, hamowanie produkcji wolnych rodników, hamowanie neutrofili i zmniejszenie peroksydacji lipidów. Chociaż podstawowy mechanizm patologiczny leżący u podstaw uszkodzenia wątroby nie jest w pełni zrozumiany, wykazano, że reaktywne formy tlenu, powstające podczas IR i apoptozy, odgrywają ważną rolę w tym procesie.

Czy inhibitory PDE mogą chronić wątrobę przed IR?

Niniejsze badanie jest pierwszym eksperymentalnym badaniem, w którym zbadano wpływ dwóch różnych inhibitorów PDE na uszkodzenie wątroby w wyniku IR. Celem tego badania było ustalenie wpływu TDF i PTX na apoptozę hepatocytów oraz ekspresję eNOS i iNOS w uszkodzeniu tkanki wątroby wywołanym przez IR.

W badaniu wykorzystano 40 samic szczurów Wistar o wadze 250-300 g, które zostały podzielone na pięć grup: grupę kontrolną (sham), grupę IR, grupę z niską dawką TDF (2,5 mg/kg), grupę z wysoką dawką TDF (10 mg/kg) i grupę PTX (40 mg/kg). Po znieczuleniu i laparotomii, lewy i środkowy płat wątroby poddano niedokrwieniu przez 90 minut, a następnie 2-godzinnej reperfuzji. Na koniec okresu reperfuzji zwierzęta zostały uśmiercone, a krew i tkanki wątroby pobrano do badań biochemicznych, histopatologicznych i immunohistochemicznych.

Analizy biochemiczne wykazały, że poziomy aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST) i gamma-glutamylotransferazy (GGT) w surowicy, które są wskaźnikami uszkodzenia wątroby, znacząco wzrosły w grupie IR, podczas gdy podawanie wysokiej dawki TDF i PTX zapobiegało temu efektowi. Nie zaobserwowano istotnej różnicy między grupą z niską dawką TDF a grupą IR. Poziomy ALT, AST i GGT były podobne w grupach z wysoką dawką TDF i PTX. Każdy z poziomów AST, ALT i GGT w surowicy był statystycznie wyższy w grupach z niską i wysoką dawką TDF oraz PTX niż w grupie kontrolnej.

Malonylodialdehyd (MDA) jest wskaźnikiem uszkodzenia wątroby związanego z peroksydacją lipidów, a całkowita zdolność antyoksydacyjna (TAC) służy do oceny stresu oksydacyjnego. Poziomy MDA i TAC w surowicy i tkankach były znacząco różne w grupie IR w porównaniu z grupami z wysoką dawką TDF i PTX, podczas gdy nie zaobserwowano istotnej różnicy w porównaniu z grupą z niską dawką TDF. Poziomy MDA i TAC w surowicy i tkankach były podobne w grupach z wysoką dawką TDF i PTX. Kwas moczowy (UA) jest uwalniany w warunkach hipoksji i jest silnym przeciwutleniaczem. Poziomy UA w surowicy były znacząco różne w grupie IR w porównaniu z grupami z niską i wysoką dawką TDF oraz PTX, podczas gdy nie zaobserwowano istotnej różnicy między grupami z niską i wysoką dawką TDF oraz PTX.

Badanie histopatologiczne wykazało, że w grupie kontrolnej wątroby wykazywały normalną architekturę zrazikową z żyłami centralnymi i promieniującymi sznurami hepatocytów, ze średnim ogólnym stopniem 0 w każdym przypadku. W grupach z niską i wysoką dawką TDF oraz PTX, nasilenie uszkodzenia wątroby wykazało znaczący spadek w porównaniu z grupą IR. Stopnie uszkodzenia wątroby w grupach z niską dawką TDF i PTX były podobne i nie różniły się istotnie. Wysoka dawka TDF wykazała najlepszy histopatologiczny efekt ochronny na uszkodzenie tkanki wątroby wywołane przez IR.

Analiza immunohistochemiczna wykazała, że apoptoza hepatocytów była znacząco wyższa w grupie IR w porównaniu z grupami z wysoką dawką TDF, PTX i grupą kontrolną, podczas gdy nie zaobserwowano istotnej różnicy w porównaniu z grupą z niską dawką TDF. Szczury leczone wysoką dawką TDF i PTX wykazały znacząco niższą liczbę komórek apoptotycznych. Wskaźniki zasięgu i intensywności ekspresji eNOS i iNOS były znacząco wyższe w grupie IR w porównaniu z grupami z wysoką dawką TDF i PTX, ale nie różniły się istotnie od grupy z niską dawką TDF. Ekspresje eNOS i iNOS były podobne w grupach z wysoką dawką TDF i PTX.

Jakie mechanizmy kryją się za ochronnymi efektami TDF i PTX?

Uszkodzenie IR wątroby dzieli się na dwie fazy. Wczesna faza obejmuje pierwsze 2 godziny po reperfuzji i jest zdominowana przez aktywację komórek Kupffera i uwalnianie różnych mediatorów, takich jak reaktywne formy tlenu i cytokiny. Późna faza, która rozpoczyna się około 6 godzin po reperfuzji i trwa do 48 godzin po reperfuzji, charakteryzuje się infiltracją neutrofili w wątrobie i postępem uszkodzenia hepatocytów i komórek śródbłonka zatokowego.

Podczas niedokrwienia, w wyniku zużycia glikogenu i braku dopływu tlenu, komórki Kupffera, komórki śródbłonka zatokowego i hepatocyty cierpią z powodu braku produkcji ATP. Brak ATP prowadzi do niewydolności zależnej od ATP pompy błony komórkowej sodu/potasu i późniejszej akumulacji Na+ wewnątrzkomórkowego, obrzęku i puchnięcia. Obrzęk komórek Kupffera i komórek śródbłonka zatokowego w połączeniu ze wzrostem naczynioskurczowej endoteliny i tromboksanu A2 oraz spadkiem wazodylatacyjnego tlenku azotu prowadzi do zwężenia zatok. Końcowym rezultatem jest znaczące zmniejszenie mikrokrążenia krwi podczas reperfuzji.

Ponadto, uszkodzenie reperfuzyjne jest spowodowane generowaniem toksycznych wolnych rodników tlenowych wraz z powrotem przepływu krwi po niedokrwieniu. Te wolne rodniki mogą reagować z lipidami w błonach komórkowych i inicjować peroksydację lipidów, która jest odpowiedzialna za uszkodzenie IR. Podczas reperfuzji po niedokrwieniu, tkanka wątroby może przeciwdziałać stresowi oksydacyjnemu poprzez regulację w górę obrony antyoksydacyjnej z pomocą enzymów antyoksydacyjnych.

NO jest ważną cząsteczką w uszkodzeniu IR i produkuje cGMP. Efekt wazodylatacyjny NO jest normalnie ograniczony przez degradację jego wtórnego przekaźnika cGMP za pośrednictwem PDE. TDF jest długo działającym inhibitorem PDE5 i może zmniejszyć degradację cGMP w tkankach. Wykazano, że inhibitory PDE5 potęgują efekt wazodylatacyjny NO, poprawiając funkcję naczyniową u pacjentów z zaburzeniami erekcji, nadciśnieniem płucnym, nadciśnieniem wrotnym i w marskości wątroby szczura. Ponadto, wykazano, że podawanie TDF może być również przydatne przeciwko uszkodzeniu niedokrwiennemu w innych narządach i tkankach, takich jak neurony, płaty wyspowe skóry, jajniki, mięsień sercowy i nerki. Baek i wsp. wykazali, że 10 mg/kg TDF hamowało apoptotyczną śmierć komórek neuronalnych i zwiększało proliferację komórek w hipokampie szczurów oddzielonych od matki.

PTX, pochodna metyloksantyny i niespecyficzny inhibitor PDE typu 4, jest klinicznie stosowany w leczeniu chromania przestankowego kończyn dolnych. Zgłoszono, że PTX wywiera efekt wazodylatacyjny, znacząco hamuje stan zapalny i zmniejsza apoptozę hepatocytów w modelach eksperymentalnych. Takhtfooladi i wsp. wykazali, że 40 mg/kg PTX zmniejszało infiltrację komórek zapalnych, krwawienie i obrzęk w uszkodzeniu płuc w wyniku IR. Sönmez i Dündar donoszą, że 50 mg/kg PTX poprawiało poziomy białek eNOS, iNOS i neuronalnej NOS oraz komórek apoptotycznych w nerkach szczura. Uważa się, że korzystne efekty PTX występują poprzez różne mechanizmy, takie jak hamowanie PDE, zwiększenie poziomów cAMP i regulacja w dół czynnika martwicy nowotworów-alfa, IL-1, IL-6, IL-12, transformującego czynnika wzrostu-β, interferonu-γ, aktywacji komórek gwiaździstych i ekspresji mRNA prokolagenu-I. Ostatnie badania sugerowały terapeutyczne efekty PTX na alkoholowe zapalenie wątroby, niealkoholowe stłuszczenie wątroby i zwłóknienie wątroby; jednak jego wpływ na uszkodzenie wątroby w wyniku IR pozostaje niejasny.

Wyniki obecnego badania wykazały, że, histopatologicznie, wysoka dawka TDF (10 mg/kg) i PTX (40 mg/kg) poprawia architekturę wątroby, nekrozę hepatocytów, krwawienie i infiltrację neutrofili w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR.

eNOS jest konstytutywnie wyrażana w komórkach śródbłonka wątroby i hepatocytach. iNOS nie jest wyrażana w normalnych okolicznościach, ale ulega regulacji w górę w różnych typach komórek, w tym w hepatocytach, neutrofilach, limfocytach T, komórkach śródbłonka, żółciowych i Kupffera w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR. Abu-Amara i wsp. donoszą, że eNOS jest niezbędnym enzymem dla ochronnych efektów w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR. Inne badanie donosi, że iNOS miała ochronne efekty przeciwko uszkodzeniu IR w sercu. Natomiast stres nitrozacyjny został również uznany za czynnik przyczyniający się do uszkodzenia komórkowego związanego z uszkodzeniem IR. Gdy iNOS i eNOS są regulowane w górę w uszkodzeniu IR, nadmierny NO wyprodukowany będzie reagował z anionem ponadtlenkowym, tworząc nadtlenoazotyn. Nadtlenoazotyn następnie pogarsza uszkodzenie poprzez peroksydację lipidów, apoptozę i nekrozę przez nitrację reszt tyrozynowych na białkach tkankowych. W naszym badaniu, wyniki immunologiczne dla zasięgu i intensywności eNOS i iNOS były znacząco zmniejszone w grupach z wysoką dawką TDF i PTX w porównaniu z grupą IR. Ten wynik można wyjaśnić zmniejszonym stresem nitrozacyjnym i hamowaniem uszkodzenia hepatocytów i komórek śródbłonka po podaniu wysokiej dawki TDF i PTX w wątrobie.

W uszkodzeniu IR, mitochondrium uczestniczy w różnych procesach patofizjologicznych. Występuje niewydolność produkcji ATP w konsekwencji zakłócenia fosforylacji oksydacyjnej spowodowanej generowaniem reaktywnych form tlenu i azotu. Zaburzenia jonowe cytosolu prowadzą do zaburzeń jonowych mitochondriów, i odwrotnie, z konsekwentnym uszkodzeniem błony plazmatycznej i mitochondrialnej, w tym tworzeniem porów przejściowej przepuszczalności mitochondrialnej. Reaktywne formy tlenu i azotu mogą powodować uszkodzenia oksydacyjne kompleksów enzymatycznych łańcucha oddechowego i uwalnianie cytochromu C do cytosolu, wyzwalając zarówno apoptotyczną, jak i nekrotyczną śmierć komórki. Ochronne efekty hamowania PDE5 zostały niedawno wykazane jako pośredniczone przez zwiększone wewnątrzkomórkowe poziomy cGMP i aktywację mitochondrialnych kanałów K-ATP bezpośrednio lub pośrednio poprzez różne szlaki sygnałowe, takie jak aktywacja kinazy białkowej C i kinazy białkowej G. Otwarcie mitochondrialnego kanału K-ATP może zapobiegać apoptozie, prawdopodobnie poprzez hamowanie akumulacji Ca²⁺ w mitochondriach podczas niedokrwienia i poprzez zachowanie potencjału błony wewnętrznej mitochondriów. Zgłoszono właściwości antyapoptotyczne inhibitorów PDE5. Sildenafil, inny inhibitor PDE, hamuje apoptozę poprzez zwiększenie wydzielania cytochromu-c i stosunku Bcl-2/Bax poprzez NO. Te mechanizmy mogą wyjaśniać niższe poziomy APAF1 w grupie z wysoką dawką TDF, a także w grupie PTX w tym badaniu. Ponadto, podawanie wysokiej dawki TDF i PTX w wątrobie może zapobiegać apoptozie i nekrozie poprzez zmniejszenie tworzenia reaktywnych form tlenu i azotu.

TAC jest używany do oceny stresu oksydacyjnego. W tym badaniu, wyższe poziomy TAC w surowicy i niższe w tkance w grupach z wysoką dawką TDF i PTX w porównaniu z grupą IR mogą być spowodowane regulacją w górę enzymatycznej obrony antyoksydacyjnej tkanki wątroby. MDA jest końcowym produktem peroksydacji lipidów i jest dobrze znanym markerem tworzenia wolnych rodników w tkance po niedokrwieniu. W naszym badaniu, poziomy MDA w wątrobie i surowicy były znacząco zmniejszone w grupach z wysoką dawką TDF i PTX w porównaniu z grupą IR. Ten stan wskazuje, że podawanie wysokiej dawki TDF i PTX zmniejszyło tworzenie wolnych rodników i peroksydację lipidów w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR.

Poziomy ALT, AST i GGT w surowicy są szeroko stosowane jako markery uszkodzenia komórek wątroby. W tym badaniu, wysoka dawka TDF i PTX promowała efekt ochronny przeciwko uszkodzeniu IR w wątrobie. UA jest uwalniany w warunkach hipoksji i działa jako silny środek redukujący i silny przeciwutleniacz. Wierzymy, że zmniejszone poziomy UA przez podawanie TDF i PTX mogłyby zminimalizować uszkodzenie wątroby.

Efektywne dawki inhibitorów PDE są różne u szczurów i ludzi ze względu na ich różną szybkość metabolizmu i okres półtrwania. Wcześniejsze badania donoszą, że okres półtrwania inhibitorów PDE u szczurów był co najmniej trzy razy krótszy niż u ludzi (0,4-1,3 godziny u szczura vs. 4 godziny u ludzi). Dlatego dawki leków stosowane u szczurów są znacznie wyższe niż dawki powszechnie stosowane terapeutycznie u ludzi. Na przykład, Kovanecz i wsp. wskazali, że dawka dzienna 20 mg/kg sildenafilu (inhibitora PDE5) u szczurów była w przybliżeniu równoważna dawce doustnej 200 mg dziennie u ludzi po skorygowaniu różnic w całkowitej powierzchni ciała.

Komórkowe wyniki uszkodzenia wątroby w wyniku IR to nekroza i apoptoza hepatocytów i komórek śródbłonka zatokowego. Klinicznie, uszkodzenie IR prowadzi do dysfunkcji wątroby, co w znacznym stopniu przyczynia się do zachorowalności i śmiertelności w chirurgii wątroby. Chociaż podjęto znaczne wysiłki badawcze, aby znaleźć i wyeliminować podstawowe przyczyny uszkodzenia wątroby w wyniku IR, wiele punktów pozostaje nadal niejasnych.

Podsumowując, wykazaliśmy, że wysoka dawka TDF i PTX ma korzystne efekty histopatologiczne i biochemiczne, które chronią przed uszkodzeniem wątroby w wyniku IR. Ten model zwierzęcy sugeruje, że suplementacja TDF i PTX może być pomocna w zapobieganiu uszkodzeniom spowodowanym przez wolne rodniki tlenowe, peroksydację lipidów, nekrozę hepatocytów i apoptozę w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR oraz w minimalizowaniu uszkodzeń wątroby. Wierzymy, że badania nad ochronnym działaniem TDF i PTX w uszkodzeniu wątroby w wyniku IR doprowadzą do właściwego zastosowania inhibitorów PDE typu 4 i 5 w praktyce klinicznej.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie wpływu inhibitorów fosfodiesterazy (PDE) – tadalafilu (TDF) i pentoksyfiliny (PTX) na ochronę wątroby przed uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym (IR). W eksperymencie na szczurach wykazano, że wysoka dawka TDF (10 mg/kg) oraz PTX (40 mg/kg) znacząco zmniejsza uszkodzenie wątroby poprzez redukcję markerów uszkodzenia hepatocytów, stresu oksydacyjnego i apoptozy. Mechanizm działania obu leków opiera się głównie na regulacji szlaku tlenku azotu i cGMP, co prowadzi do poprawy mikrokrążenia wątrobowego oraz zmniejszenia stresu oksydacyjnego i nitrozacyjnego. Wyniki wskazują na potencjalne zastosowanie inhibitorów PDE w praktyce klinicznej, szczególnie w chirurgii wątroby i transplantologii, gdzie uszkodzenie IR stanowi poważne powikłanie.